熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)是一種能夠實(shí)現快速、精確、靈敏檢測的分子生物學(xué)方法。其原理是在PCR反應過(guò)程中同時(shí)監測靶基因擴增產(chǎn)物數量的動(dòng)態(tài)變化，從而推算出樣本中對應靶基因初始含量的一種手段。

 

　　熒光定量PCR試劑盒是熒光定量PCR技術(shù)的重要組成部分，在熒光定量PCR實(shí)驗中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。熒光定量PCR試劑盒通常包括模板DNA、引物（Forward和Reverse）以及探針（Probe）、酶（如Taq DNA聚合酶）、熒光染料等多種組分，這些試劑分別發(fā)揮不同作用協(xié)同完成PCR反應。

 

　　熒光定量PCR試劑盒中的引物和探針的設計與選擇具有很高的專(zhuān)業(yè)性和針對性，在針對不同的目的和實(shí)驗設計情況下具有各自?xún)?yōu)劣。引物序列需要與所需擴增的靶基因區域匹配，引物都有向前和向后兩個(gè)方向，以保證對兩側位于核苷酸互補鏈上的DNA序列進(jìn)行擴增。而探針則要求與引物具有一定的覆蓋長(cháng)度，其序列應優(yōu)化至適合搭配引物并兼顧熒光特性和檢測靈敏度。目前常用的探針是TaqMan探針、MGB探針和MolecularB beacon等。

 

　　同時(shí)，在PCR反應的早期，反應產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)品通過(guò)DNA雙鏈發(fā)生耦合阻礙擴增產(chǎn)物的累積，嚴重影響了PCR檢測結果的準確性。為此，熒光定量PCR試劑盒需要添加Uracil-DNA聚合酶(UDG)和dUTP將殘余外源DNA分解，降低污染以及所得PCR擴增產(chǎn)物的假陽(yáng)性率，提高PCR實(shí)驗的穩定性和準確度。

 

　　除此之外，熒光定量PCR試劑盒增加熒光染料和探測器以實(shí)現實(shí)時(shí)監控和定量 PCR 反應，它能夠不斷進(jìn)行獲取數據，在PCR過(guò)程中計算核酸擴增本原數量，并在實(shí)時(shí)顯示屏幕上展示出制品的表達大小。因此，熒光定量PCR技術(shù)廣泛應用于基因分型和基因定量以及細胞凋亡等相關(guān)研究。